近日，中國水產科學研究院長江水產研究所曾令兵研究員團隊在鯉皰疹病毒2型酵母疫苗方面研究取得重要進展。研究論文“Protective immunity in gibel carp, Carassius gibelio of the truncated proteins of cyprinid herpesvirus 2 expressed in Pichia pastoris”于11月10日在Fish & shellfish immunology在線發表。長江所周勇助理研究員為論文第一作者，曾令兵研究員為論文通訊作者。

　　鯽是我國長江流域及南方地區廣為養殖的淡水魚類之一，其主要養殖品種異育銀鯽因其食性雜、適應能力與繁殖能力強、抗逆性好以及味道鮮美、營養價值高等優點，而深受廣大養殖者與消費者喜愛。但近年來，我國鯽魚主養區域的病害問題日趨嚴重，養殖的異育銀鯽暴發一種以出血為典型癥狀的疾病而大規模死亡，經濟損失非常嚴重。經過多年研究確定導致養殖異育銀鯽大規模死亡的是一種病毒性疾病。通過對患病異育銀鯽腎臟、脾臟組織的超薄切片電鏡觀察、組織病理學、細胞培養試驗及PCR等分子方法檢測，證實引起異育銀鯽大規模死亡的出血性疾病為鯽造血器官壞死癥（Crucian Carp Hematopoietic Necrosis），其病原為鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）。由于CyHV-2對養殖鯽魚的感染事件多有發生，故其致病機理和疫苗研發是近幾年研究的重點。

　　長江所魚病室通過對鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）ORF25、25C和25D基因抗原決定簇分析，設計特異性引物，將其截短基因定向克隆到酵母表達載體pPICZα B中，構建重組質粒并命名為pPICZα-tORF 25、pPICZα-tORF 25C和pPICZα-tORF 25D。將重組質粒轉化到酵母菌株KM71中進行表達與篩選。通過免疫膠體金技術觀察到表達的蛋白可吸附于鯽魚腦細胞表面。將重組蛋白與鯽魚腦細胞孵育后接種CyHV-2發現，tORF 25組 (104.1/ml) TCID50 低于tORF 25C組 (104.6/ml) 和 tORF 25D組 (105/ml) TCID50。將重組蛋白以20μg/尾劑量經背部肌肉注射免疫健康鯽魚，免疫后白細胞介素11基因表達量明顯增加，在免疫后第4天達到峰值，而補體C3基因在第7天達到峰值。血清中和試驗結果表明，免疫tORF 25蛋白的鯽魚最高抗體滴度為327，高于tORF 25C（247）和 tORF 25D（228）蛋白免疫的鯽魚抗體滴度。攻毒感染試驗結果顯示，免疫tORF 25、tORF 25C和tORF 25D蛋白的鯽魚相對存活率為75%、63%和54%。本研究為畢赤酵母表達的tORF 25、tORF 25C和tORF 25D蛋白作為潛在候選疫苗應用于CyHV-2的預防和控制奠定了前期基礎。

圖1 pPICZα-tORF 25，pPICZα-tORF 25C和pPICZα-tORF 25D載體構建示意圖

圖2 鯽魚免疫CyHV-2截短蛋白后保護效率研究

（Zhou Yong, Jiang Nan, Ma Jie, Fan Yuding, Zhang Linlin, Xu Jin, Zeng Lingbing. Protective immunity in gibel carp, Carassius gibelio of the truncated proteins of cyprinid herpesvirus 2 expressed in Pichia pastoris [J]. Fish & shellfish immunology, 2015. 47(2): 1024-1031. doi:10.1016/j.fsi.2015.11.012. ）

（來源：魚病室 周勇）